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肝素誘導(dǎo)性血小板減少癥 (HIT) 是對(duì)抗凝劑肝素的嚴(yán)重免疫反應(yīng)。該病癥表現(xiàn)為血小板減少癥（血小板計(jì)數(shù)低）和動(dòng)脈或靜脈血栓形成。如果不及時(shí)治療，HIT 可導(dǎo)致心臟病發(fā)作、中風(fēng)、肺栓塞、動(dòng)脈阻塞、肢體壞疽和死亡。

在 HIT 中，抗體識(shí)別血小板因子 4 (PF4) 和肝素或多聚陰離子并與之形成復(fù)合物。該免疫復(fù)合物與 Fc?RIIa 受體相互作用，導(dǎo)致血小板活化和聚集。血小板活化會(huì)導(dǎo)致釋放刺激凝血并延續(xù)循環(huán)的因子。

但其他因素會(huì)導(dǎo)致 HIT 中的血栓形成，例如中性粒細(xì)胞活化。HIT 免疫復(fù)合物與中性粒細(xì)胞上的 Fc?RIIa 受體的結(jié)合會(huì)誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞胞外陷阱 (NET) 的釋放和 NETosis，這是一種受調(diào)節(jié)的細(xì)胞死亡過(guò)程。

到目前為止，HIT 中 NET 形成的分子機(jī)制尚未了解。可能涉及特定激動(dòng)劑，如二核苷酸磷酸 (NADPH)、氧化酶 (NOX) 和氧物種 (ROS)。新南威爾士大學(xué) (澳大利亞悉尼) 的研究人員調(diào)查了 ROS 和 NOX 是否是 HIT 誘發(fā)的血栓形成所必需的，以便更好地了解這些機(jī)制。

研究概述

HIT 樣本

研究人員從健康志愿者和 HIT 患者身上采集血液樣本。

微流體研究

該小組使用點(diǎn)成Vena8 Fluoro+ 生物芯片微通道進(jìn)行了微流體研究。

首先，他們?cè)?4C 下用纖維蛋白原或血管性血友病因子 (WWF) 覆蓋微芯片過(guò)夜。用牛血清清洗和阻斷微芯片后，他們用 DPI（一種 ROS 抑制劑）孵育來(lái)自健康供體的新鮮檸檬酸抗凝全血。他們用純化的 IgG（HIT 或正常）和肝素對(duì)其進(jìn)行處理。

針對(duì)中性粒細(xì)胞的 ROS 抑制試驗(yàn)

研究人員在本次實(shí)驗(yàn)中使用了經(jīng)過(guò)或未經(jīng)過(guò) DPI 處理的中性粒細(xì)胞耗盡血液。他們用 Hoechst 33342、Sytox Green、抗 CD41 或 AP2、抗 CD15 和 CellROX 標(biāo)記樣本。然后，他們以 67 達(dá)因/cm2（1500 s-1）的剪切應(yīng)力灌注血液長(zhǎng)達(dá) 30 分鐘。

為了可視化生物芯片，他們使用 Q-Imaging EXi Blue 相機(jī)連接到由 VenaFluxAssay 軟件（點(diǎn)成Cellix Ltd）驅(qū)動(dòng)的熒光顯微鏡，然后進(jìn)行定量分析。

結(jié)果

HIT 中的血栓形成需要中性粒細(xì)胞衍生的 ROS

當(dāng)研究人員分析血栓時(shí)，他們看到血凝塊內(nèi)有大量的血小板、中性粒細(xì)胞、ROS 和釋放的 DNA（圖 3A）。 HIT 患者的循環(huán)血小板和中性粒細(xì)胞也產(chǎn)生了更多的 ROS。

HIT 中的血栓形成需要中性粒細(xì)胞衍生的 ROS

當(dāng)研究人員分析血栓時(shí)，他們發(fā)現(xiàn)血凝塊內(nèi)有大量的血小板、中性粒細(xì)胞、ROS 和釋放的 DNA（圖 3A）。HIT 患者的循環(huán)血小板和中性粒細(xì)胞也產(chǎn)生了更多的 ROS。

圖 3A 來(lái)自 Chong 等人。HIT IgG 誘導(dǎo)的 NETosis 和含有 ROS 的血栓。（A）全血中 KKO 誘導(dǎo)的血栓的共聚焦顯微鏡圖像，顯示血小板（紅色）、中性粒細(xì)胞（綠色）、ROS（洋紅色）和 DNA 釋放（藍(lán)色）。

KKO 和 HIT IgG 誘發(fā)的血栓顯示細(xì)胞外 DNA、血小板和中性粒細(xì)胞明顯沉積（圖 4 A-B）。用 DPI 處理血液可顯著減少這些成分和血凝塊大小。這一觀察結(jié)果證實(shí)了 ROS 在 HIT 相關(guān)血栓形成中的核心作用。

圖 4A-B 來(lái)自 Chong 等人。抑制 ROS 可減少血凝塊形成和流動(dòng)條件下的 NET 釋放。（A）用同型對(duì)照和肝素或 KKO 和肝素加載體對(duì)照或 DPI 處理的全血的熒光圖像。（B）用正常人 IgG (hIgG) 和肝素或代表性 HIT IgG 和肝素加載體對(duì)照或 DPI 處理的全血。細(xì)胞外 DNA（藍(lán)色）、中性粒細(xì)胞（綠色）和血小板（紅色）。

HIT 中的中性粒細(xì)胞衍生 ROS 和血栓形成

在用載體處理的中性粒細(xì)胞重建的 HIT IgG 處理血液中，研究人員觀察到充滿細(xì)胞外 DNA、中性粒細(xì)胞和血小板的大凝塊。他們?cè)谟谜?IgG 處理的重建血液中沒(méi)有觀察到這些特征（圖 5）。

圖 5 來(lái)自 Chong 等人。針對(duì)中性粒細(xì)胞的 ROS 抑制阻斷了全血中的 NET 和血栓形成。（A）熒光圖像顯示細(xì)胞外 DNA（藍(lán)色）、中性粒細(xì)胞（綠色）和血小板（紅色）。

用 DPI 處理重組血液可顯著減少 HIT IgG 治療后的 DNA、中性粒細(xì)胞和血小板沉積。

這些數(shù)據(jù)表明中性粒細(xì)胞衍生的 ROS 與 HIT 中的血栓形成之間存在直接聯(lián)系。

本研究中的其他實(shí)驗(yàn)

中性粒細(xì)胞中的 ROS 生成

實(shí)驗(yàn)涉及用 HIT 患者 IgG 或 KKO、PF4 和肝素刺激純化的中性粒細(xì)胞。KKO 處理的中性粒細(xì)胞顯示出增強(qiáng)的 ROS 生成。

HIT IgG 介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞活化和 NETosis

該實(shí)驗(yàn)涉及在肝素存在下用 KKO 或 HIT IgG 治療健康血液。與對(duì)照組相比，治療增加了全血和 LDG 群體中經(jīng)歷 NETosis 的中性粒細(xì)胞。DNP 和 DPI 阻斷了 HIT IgG 誘導(dǎo)的 LDG 中的 ROS 生成。

體內(nèi)研究

該小組還使用表達(dá)人類 Fc?RIIa 的 R131 異構(gòu)體和人類 PF416 的雙轉(zhuǎn)基因 Fc?RIIa+/hPF4+ 小鼠進(jìn)行了動(dòng)物研究。他們注射了 HIT 樣單克隆抗體 KKO 和肝素以在這些動(dòng)物中誘導(dǎo) HIT。然后，他們給動(dòng)物施用 ROS 抑制劑，并分析其肺部和血小板計(jì)數(shù)。

這些實(shí)驗(yàn)的主要發(fā)現(xiàn)

未經(jīng) DPI 治療的 KKO 治療小鼠肺部出現(xiàn)大量發(fā)光積累。DPI 治療降低了發(fā)光，表明 ROS 受到抑制。（補(bǔ)充圖 5A）
經(jīng) DPI 治療的 HIT 小鼠循環(huán)中活化中性粒細(xì)胞 (LDG) 和 ROS+ 細(xì)胞減少，與對(duì)照水平相似。這些結(jié)果與微流體觀察結(jié)果一致，其中 ROS 抑制阻斷了中性粒細(xì)胞活化。（補(bǔ)充圖 5D）
用 KKO 和肝素治療的小鼠肺部出現(xiàn)密集的血小板積聚和血栓形成。（圖 6）
用 DPI 抑制 ROS 可減少 HIT 誘導(dǎo)的血栓形成，支持微流體研究。
DPI 無(wú)法預(yù)防血小板減少和體溫過(guò)低。

結(jié)論

研究人員得出結(jié)論：

ROS 和 NOX2 在 HIT 中的 NETosis 和血栓形成中起著至關(guān)重要的作用。
NOX2 可能是 HIT 抗血栓治療的新治療靶點(diǎn)。

實(shí)驗(yàn)室解決方案

如果您對(duì)上述實(shí)驗(yàn)感興趣，這是您在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行類似實(shí)驗(yàn)所需的設(shè)備：

點(diǎn)成Vena8 Fluoro+ 生物芯片 – 模擬人體血管和血凝塊，詳情見(jiàn)下方鏈接。
點(diǎn)成Mirus Evo 泵或點(diǎn)成ExiGo 泵 – 控制生物芯片中的剪切速率（流速）；這使您可以將剪切速率設(shè)置為模擬微血管或其他血管中血栓形成的流速的設(shè)置。
微環(huán)境室 – 這是一個(gè)溫控框架，生物芯片位于其中，它將所有溫度保持在 370C。微環(huán)境室位于顯微鏡臺(tái)上。
倒置顯微鏡 – 我們提供帶有 VenaFlux Pro 選項(xiàng)的 Zeiss AxioVert A1 或帶有 VenaFlux Elite 選項(xiàng)的 Zeiss AxioObserver7。
數(shù)碼相機(jī) – 用于捕捉圖像和視頻錄制。我們?yōu)?Prime BSI Express 提供 VenaFlux Pro 和 Elite 選項(xiàng)。這是一款出色的相機(jī)，具有高幀率，適合血栓研究。
Image Pro 細(xì)胞分析軟件 – 用于分析實(shí)驗(yàn)中的圖像和視頻。

如果您的實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)擁有其中一些物品（如倒置顯微鏡、相機(jī)或細(xì)胞分析軟件），我們推薦 VenaFlux 入門(mén)套件。

點(diǎn)成Vena8 Fluoro+ 生物芯片

點(diǎn)成Mirus Evo™ 納米泵

點(diǎn)成ExiGo微流體注射泵

參考文獻(xiàn)

Leung, Halina HL, et al. “Inhibition of NADPH oxidase blocks NETosis and reduces thrombosis in heparin-induced thrombocytopenia.” Blood Advances 5.23 (2021): 5439-5451.

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微流控專題 | 抑制NADPH氧化酶阻斷NETosis并減少肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥中的血栓形成