嵌合抗原受體（CAR）是經過改造后賦予T細胞靶向特定抗原的新能力的受體蛋白。這些受體是嵌合的，因為它們將抗原結合和T細胞激活功能結合到一個受體中。CAR-T細胞療法使用經過CAR改造的T細胞來治療癌癥。CAR-T免疫療法的前提是修改T細胞識別癌細胞，以便更有效地靶向和消滅它們。科學家從人體中獲取T細胞，對其進行基因改造，然后將產生的CAR-T細胞注入患者體內以攻擊他們的腫瘤。
自2018年獲得FDA批準以來，CAR-T療法已使血液惡性腫瘤患者的緩解率達到80%。與所有過繼細胞療法一樣，自體或同種異體CAR-T療法的生產是一個復雜的生物制造過程，需要嚴格遵守監管和QA/QC指南。為了確保最終產品的安全性、質量和功效，必須在整個開發和生物加工流程的過程中評估和監控細胞的健康和活力。在此，我們演示了如何使用LUNA-FX7細胞計數儀來監測和評估CAR-T過程中關鍵階段的細胞健康狀況：
（1）收集主要來源材料
（2）白細胞分離后
（3）分離/激活
（4）擴增
（5）生產
使用核酸染色劑吖啶橙和碘化丙啶（AO/PI）在熒光細胞計數模式下使用LUNA-FX7進行細胞計數。簡而言之，對于每次計數，將2 μl預混合AO/PI溶液與18μl細胞混合，裝入2、3或8通道載玻片中，并利用自動對焦功能進行計數。對于最終劑量測定，使用分析體積為5.1 μl（大多數自動化體積的10倍）的LUNA 1通道載玻片。
1、全血樣本的初始白細胞濃度和活力
在采血完成后和進行白細胞分離前，用1x PBS按1：100稀釋細胞，以便在LUNA-FX7中計數。盡管白細胞(WBC)僅占全血的2%，但如圖展示了如何輕松區分異質群體中的有核細胞和無核細胞（紅細胞）。
明場(BF)、綠色通道(GF)和紅色通道(RF)的平鋪圖像(A)。標記的(活/死有核細胞)圖像的疊加圖像(B、C)。1/100稀釋血液的白細胞總數和活力(D)
熒光細胞計數模式下CAR-T細胞的實驗方案參數設置
2、白細胞的分離
白細胞去除術是從全血中分離白細胞的過程。下圖顯示了2個不同樣品的活力。兩個樣本中均未發現紅細胞，但仍可觀察到一些細胞碎片。同樣，LUNA-FX7可以輕松區分細胞和細胞碎片，限度地減少誤報計數的可能性。
白細胞分離后的細胞濃度和活力。白細胞分離后的WBC樣本計數以及BF、GF和RF原始圖像(A)、FL標記圖像和放大圖像(B、C)。評估兩個樣品并繪制細胞濃度和活力圖（D，E）
3、T細胞的分離和激活
白細胞分離后，T細胞被進一步分離并激活，產生同質T細胞群。此階段，樣本質量存在明顯對比。
分離和激活后對T細胞進行計數，以及BF、GF和RF原始圖像(A)、FL標記圖像和放大圖像(B、C)。假陽性碎片可以通過最小細胞大小設置(D)來消除。評估兩個樣品并繪制細胞濃度和活力圖（E、F）
4、CAR表達的T細胞
分離并激活的 T 細胞通過逆轉錄病毒轉導，產生嵌合抗原受體 (CAR)。轉導后，新設計的CAR-T細胞再離體擴增。下圖顯示了細胞活力和擴增的CAR-T細胞數量。
CAR-T細胞擴增后的細胞濃度和活力。CAR-T細胞樣本的原始圖像和標記圖像（A、B、C）以及細胞濃度和活力（D、E）
5、CAR-T細胞產品
擴增的CAR-T細胞被冷凍保存并評估劑量。如圖顯示具有不同細胞活力的2個樣品的活力和濃度。
結論
從最初收集主要原材料到最終劑量確定，LUNA-FX7™滿足在整個CAR-T生產過程中監測細胞健康和活力的需求。此外，結合預設的驗證載玻片、內部QC軟件和可選的21 CFR Part 11合規軟件，可確保滿足和維持嚴格的QC和監管指南。
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