PCR是基于DNA聚合反應(yīng)原理的體外技術(shù)，它依賴于PCR儀，其包括反復(fù)加熱和冷卻反應(yīng)的循環(huán)，用于使用熱穩(wěn)定DNA聚合酶，引物序列和脫氧核糖核苷三磷酸進(jìn)行DNA融化和酶的DNA復(fù)制。因此它可以將DNA的特定序列擴增多達(dá)十億次，大多數(shù)PCR方法可以擴增高達(dá)10千堿基對的DNA片段。以下是建立PCR反應(yīng)所需的基本組件和試劑。
1、微量離心管是一個小圓柱形塑料錐形容器，錐形底部帶有卡帽，它們由聚丙烯制成，可以承受各種溫度。
2、PCR儀是一種用于擴增DNA片段的儀器，有一個帶孔的熱塊，可以插入容納PCR反應(yīng)混合物的管子，循環(huán)儀的工作原理是珀耳帖效應(yīng)，它通過反轉(zhuǎn)電流以預(yù)編程的方式升高和降低模塊的溫度，薄壁反應(yīng)管允許有利的導(dǎo)熱性以允許快速熱平衡。
3、DNA模板，反應(yīng)溶液應(yīng)至少含有1e5到1e6目標(biāo)分子。
4、引物，這些是定義待擴增序列的寡核苷酸，兩個引物與DNA靶的有義鏈和反義鏈各自的游離羥基末端互補，熔化溫度高于65攝氏度的底漆具有二次退火的趨勢。引物中GC含量應(yīng)為40至60％。
5、 MgCl2是酶的輔助因子，優(yōu)化鎂離子濃度是有益的，鎂離子影響引物退火，和PCR產(chǎn)物的鏈解離溫度，產(chǎn)物特異性，引物二聚體偽影的形成和酶活性和保真度，聚合酶需要結(jié)合的游離鎂。
6、KCl，KCl用于反應(yīng)以促進(jìn)引物退火。
7、明膠或牛血清，包括高壓滅菌的明膠或無核酸酶的牛血清白蛋白，以幫助穩(wěn)定酶。
8、蒸餾水，使用高壓蒸餾的蒸餾水，體積取決于反應(yīng)。
9、脫氧環(huán)核苷三磷酸，這些是DNA構(gòu)建模塊，dNTP，dCTP，dATP和dGTP溶液中和至pH7.0。將初級儲備溶液稀釋至10mM，等分，并在零下20℃下儲存。推薦每種dNTP含有1mM的工作儲備液。在重復(fù)PCR循環(huán)期間，dNTP的穩(wěn)定性使得在50個循環(huán)后約50％仍為dNTP。dNTP濃度在20和200微米之間對于反應(yīng)是較佳的。
10、DNA聚合酶，它是一種催化反應(yīng)的酶，從生長在溫泉中的水生棲熱菌中分離的TaqDNA聚合酶，在72攝氏度時表現(xiàn)較佳，90攝氏度的變性溫度不會破壞其酶活性。推薦濃度的Taq聚合酶為每100uL反應(yīng)，然而酶活性將隨個體靶模板或引物而變化。 PCR反應(yīng)建立在20到40個重復(fù)循環(huán)上，其中溫度在每個循環(huán)中變化。循環(huán)從高溫的單一溫度步驟開始，然后在末端保持一次以進(jìn)行產(chǎn)品延伸或短暫儲存。
文章來源：上海靳瀾儀器制造有限公司/pcr/index.html
網(wǎng)站客服
