到目前，科學家們已經發展了多種全內反射熒光顯微成像系統。其中普遍的兩種類型是棱鏡型和物鏡型。棱鏡型成像系統的隱失場是通過入射光經棱鏡發生全反射產生的，而物鏡型的是通過入射光經物鏡本身全反射產生。隱失波激發生物樣品的熒光分子，熒光分子所發射的熒光經過物鏡成像到照相機或CCD上實現對生物樣品的記錄。
兩種形式的顯微鏡各有優缺點，對于棱鏡型而言，實現起來相對簡單，同時它的缺點也很明顯：由于要達到較高的光學分辨率，要求接收熒光的物鏡工作距離較短，這樣留給生物樣品和物鏡之間的空間較小，所以在此儀器上安裝一些諸如原子力顯微鏡、近場光學顯微鏡等其他探測儀器非常困難。
并且由于熒光的接收必須經過被觀察樣品的上部，這樣熒光必然會有散射、衰減及其它光信號的干擾，使觀察的效果有所下降。而對物鏡式而言，則可以克服以上缺點。物鏡式顯微鏡的物鏡既作為收集樣品熒光信號的接受器，同時又作為發生全反射的光學器件。
激光聚焦到物鏡后焦面并經過物鏡邊緣入射，物鏡出射光為平行光并斜入射至蓋玻片上，調節激光入射位置和角度，即可達到全內反射要求，從而實現隱失波照明。隱失波所激發的熒光仍舊經過物鏡接收，通過雙色鏡濾掉除熒光以外的其它波長的光，成像在物鏡后方的照相機或CCD上，實現對生物樣品的熒光記錄。由于樣品上方空間空出，并且所接受的熒光沒有被樣品干擾，所以目前大多數生物學家采用物鏡式全內反射熒光顯微鏡。
