枸杞多糖的超聲法提取法及抗氧化性研究
2023年09月04日 15:39:33
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枸杞多糖的超聲法提取法及抗氧化性研究
1、枸杞多糖的含量測定
1）、標準曲線的繪制 精密稱取于105％干燥至恒重的對照品100 mg，加入100 ml容量瓶中，用純化水溶解至刻度。分別精密移取對照品儲備液0．5，1．0，2．0，3．0，4．0，5．0 ml于100 ml量瓶中，加水稀釋至刻度，然后各取1．0 ml于10 ml比色管中，分別加入5％ 的溶液1．0 ml，搖勻后加入5．0 ml濃硫酸，立即搖勻，在沸水浴中加熱15 min，冷卻至室溫。以純化為空白對照，在487 nm處測吸光度值A。以吸光度值為橫坐標，濃度為縱坐標，繪制標準曲線。
2）、樣品含量的測定 取干燥的枸杞多糖供試品，按實際實驗結果將其稀釋至合適濃度。精密吸取待測液1．0 ml，置于10 ml比色管中，按“2．1．1”方法顯色，測定A值，按公式計算多糖含量。按下式計算多糖含量(% ) = 3. 17C × D /W×100％,式中C為樣品溶液的葡萄糖質量濃度(mg／m1)，D為樣品溶液的稀釋倍數，f為換算因子(f=3．17) ，w為樣品質量(mg)
2、正交試驗考察提取工藝（單因素試驗）
1）、料液比的影響 稱取枸杞樣品4份，均為5g，分別加入lO、20、30、40倍水量，在50℃，pH=7，超聲提取30 min，濃縮至20 ml左右，加5倍95％乙醇沉淀，沉淀再溶解，測定吸光度，從而比較多糖含量的提取率。
2）、時間的影響 稱取枸杞樣品4份，均為5 g，加入10倍水量，在50~C，pH=7，分別超聲提取10 min、20 min、30 min、40min，濃縮至20 ml左右，加5倍95％ 乙醇沉淀，沉淀再溶解，測定吸光度，從而比較多糖含量的提取率。
3）、溫度的影響 稱取枸杞樣品4份，均為5 g，加入10倍水量，分別在40℃、50℃ 、60℃ 、70℃ ，pH=7，超聲提取從而比較多糖含量的提取率。
4)、pH值的影響 稱取枸杞樣品4份，均為5 g，分別加入10倍水量，分別在pH=7、8、9、10，50℃ ，超聲提取30 min，濃縮至20 ml左右，加5倍95％乙醇沉淀，沉淀再溶解，測定吸光度，從而比較多糖含量的提取率。
3、正交試驗設計
根據影響多糖提取的單因素試驗結果，考察多因素對多糖得率及含量的影響，按正交設計表L9(3 )進行試驗，每次取干燥枸杞子5．0 g，按2中單因素試驗的因素和水平設計正交實驗設計進行提取，提取完后過濾，濃縮濾液至20ml左右，置于100 ml的帶塞錐形瓶中，加入95％ 乙醇100 ml，靜置16 h。將醇沉液離心分離(3000 r／min，10 min)，固形物分別用95％乙醇、無水乙醇、丙酮洗滌，水浴加熱干燥得枸杞粗多糖，稱重。
表3 枸杞多糖超聲波提取法的正交因素水平表
水平 因素
料液比 A 溫度/℃ B PH C 時間/h D
1 1：10 40 7 10
2 1：20 50 8 20
3 1：30 60 9 30
4 1：40 70 10 40
4、工藝改進
我對于超聲波提取法進行進一步的改進，前面我們對于超聲波提取法的提取時間、pH值、溫度和料液比的工藝條件已經確定，對于超聲波提取次數進行改進。做一個單因素試驗，提取次數分別設定為1、2、3次。
5、枸杞多糖的抗氧化性研究
1）、枸杞多糖的還原性的測定
取2.5 ml多糖樣品于試管中, 依次加入2.5m l 2. 5mol/L磷酸鹽緩沖液( phosphatebu ffer saline, PBS, pH 6. 6)和2. 5m l 1%六氰合鐵酸鉀溶液(K3 Fe(CN )6 ), 50℃下保溫20 min 后快速冷卻, 再加入25m l 10%三氯醋酸溶液( TCA ), 以3 000 r /m in 的轉速離心10m in, 取上清液2.5 ml,依次加入2. 5 m l蒸餾水, 0. 5 ml 0. 1%、三氯化鐵溶液( FeCl3), 充分混勻, 靜置10m in后, 在700 nm下測定其吸光度值(以蒸餾水代替樣品的混合液作參比溶液), 吸光度值越高還原力越強。
2）、枸杞多糖清除超氧陰離子自由基的能力
采用鄰苯三酚自氧化法, 取4. 50ml 0.1mol/L Tris-HCl緩沖液( pH 8. 2), 依次加入1.00ml乙二胺四乙酸鈉( EDTA )溶液, 1.00m l樣品溶液, 2.40 ml水, 混勻, 于25℃水浴中反應10min, 再加入100ul 9 mmol/L 鄰苯三酚, 加入時計時, 混勻, 準確反應60 m in后, 加入50ul 2mol/L HCl溶液, 終止反應, 在325 nm處測定吸光度值As?？瞻坠芤?.00m l蒸餾水代替1.00 ml樣品, 操作方法同樣品管, 可測得空白管的吸光度Ac。
清除率(% )=（Ac-As）/Ac×100
As: 含有待測物的反應液于325 nm的吸光度值
Ac: 不含有待測物的反應液于325 nm 的吸光度值
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