分光光度計的使用
2023年01月10日 10:03:37
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分光光度計的使用
分光光度計已成為現代分子生物學實驗室的常規儀器。常用于核酸、蛋白質定量和細 菌生長濃度的定量。 分光光度計采用可產生多種波長的光源。通過一系列分光光度計，產生特定波長的光源。光源通過被測樣品后，部分光源被吸收，計算出樣品的吸光度值，換算成樣品濃度。樣品的吸光度與樣品的濃度成正比。 核酸定量 核酸定量是分光光度計*常用的功能。它可以量化溶解在緩沖液中的寡核苷酸、單鏈、雙鏈 DNA 和 RNA。核酸*高吸收峰的吸收波長為260 nm。每種核酸的分子組成不同，因此其換算系數也不同。要對不同類型的核酸進行定量，必須事先選擇相應的系數。例如1OD的吸光度相當于50μg/ml dsDNA、37μg/ml ssDNA、40μg/ml RNA和30μg/ml Olig。將試驗后的吸光度值按上述系數換算得到相應的樣品濃度。測試前，選擇正確的程序，輸入原溶液和稀釋劑的體積，然后測試空白溶液和樣品溶液。然而，實驗并非一帆風順。不穩定的讀數可能是實驗者*頭疼的問題。儀器的靈敏度越高，吸光度的變化就越大。 實際上，分光光度計的設計原理和工作原理是允許吸光度值在一定范圍內變化的，即儀器具有一定的準確度和精密度。例如，Eppendorf Biophotometer 的準確度≤1.0% (1A)。此類多次測試的結果在平均值約 1.0% 之間波動是正常的。此外，還應考慮核酸本身的理化性質以及溶解核酸的緩沖溶液的pH值和離子濃度。測試過程中，離子濃度過高，也會造成讀數漂移。因此，建議使用一定的pH值和低離子濃度。緩沖器，例如 TE，可以極大地穩定讀數。樣品的稀釋濃度也是一個不可忽視的因素：樣品中難免會有一些細小的顆粒，尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在會干擾測試效果。為了盡量減少顆粒對檢測結果的影響，要求核酸吸光度值至少大于0.1A，吸光度值優選為0.1-1.5A。在此范圍內，粒子干擾較小，結果穩定。這意味著樣品的濃度不能超過低或過高（超出光度計的測試范圍）。*后是操作系數，如果混合充分，否則吸光度值太低，甚至為負；混合溶液不能有氣泡，空白溶液不能有懸浮物，否則讀數會急劇漂移；測試空白溶液和樣品必須使用同一個比色皿，否則濃度差異過大；換算系數與樣品濃度單位選擇相同；不能使用帶有磨損窗口的比色皿；樣品體積必須達到比色皿和許多其他操作所需的*小體積。 除了核酸濃度，分光光度計還顯示幾個非常重要的比值來表示樣品的純度，比如A260/A280的比值，用來評價樣品的純度，因為蛋白質是280nm。對于純樣品，該比率大于 1.8 (DNA) 或 2.0 (RNA)。如果比值低于1.8或2.0，則表明受到蛋白質或酚類物質的影響。 A230表示樣品中含有糖類、肽類、酚類等污染物。相對純核酸的A260/A230比值大于2.0。 A320 檢測溶液的濁度和其他干擾因素。對于純樣品，A320一般為0。 蛋白質的直接定量（UV 法） 這種方法是在280nm波長直接檢測蛋白質。光度計可直接顯示樣品濃度，或選擇相應的換算方法將吸光度值換算成樣品濃度。蛋白質測定過程很簡單，先測空白溶液，再直接測蛋白質。因為buffer中有一些雜質，一般需要去掉320nm的“背景”信息，將此功能設置為“on”。與待測核酸類似，要求A280的吸光度值至少大于0.1A，*佳線性范圍在1.0-1.5之間。實驗中選擇Warburg公式顯示樣品濃度時，發現讀數“漂移”。這是正常現象。其實只要A280的吸光度值變化幅度不超過1%，就說明結果很穩定。漂移的原因是Warburg公式的吸光度值換算成濃度，乘以一定的系數。只要吸光度值稍有變化，就會放大濃度，使結果非常不穩定。直接蛋白質定量方法適用于檢測純度較高且成分相對單一的蛋白質。與比色法相比，紫外直接定量法快速、易操作；然而，它容易受到平行物質的干擾。如DNA干擾；此外，靈敏度低，需要更高濃度的蛋白質。 比色蛋白質定量 蛋白質通常是多種蛋白質的化合物。比色測定的基礎是蛋白質成分：氨基酸（如、）與額外的顯色基團或染料反應產生有色物質。有色物質的濃度與蛋白質反應的氨基酸數量直接相關，從而反映蛋白質的濃度。 比色法一般有BCA、Bradford、Lowry等方法。 洛瑞法：基于*早的雙縮脲反應并改進。蛋白質與 Cu2+ 反應產生藍色反應物。但與雙縮脲相比，洛瑞法更為靈敏。缺點是需要依次加入幾種不同的反應試劑；反應需要很長時間；易受非蛋白質物質影響；含有 EDTA、Triton x-100、硫酸銨和其他物質的蛋白質不適合該方法。 BCA（二辛可寧酸測定）方法：這是一種更新且更靈敏的蛋白質測試方法。待分析蛋白質在堿性溶液中與Cu2+反應生成Cu+，Cu+與BCA形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰位于562nm。這種化合物與蛋白質濃度有很強的線性關系，反應后形成的化合物非常穩定。與Lowry法相比，操作簡單，靈敏度高。但與 Lowry 方法類似，它容易受到蛋白質和洗滌劑之間的干擾。 布拉德福德法：該法的原理是蛋白質與考馬斯亮藍結合反應，產生吸收峰為595nm的有色化合物。其*大特點是靈敏度好，是Lowry和BCA測試方法的兩倍；操作更簡單、更快捷；只需要一種試劑；化合物可穩定1小時，便于結果；干擾 Lowry 和 BCA 反應的還原劑（如 DTT、巰基乙醇）是兼容的。但它仍然對洗滌劑敏感。主要缺點是不同的標準會導致同一個樣本的結果有很大的差異，是不可比的。 一些**次接觸比色測量的研究人員可能會被各種比色方法的不一致結果所迷惑。我應該相信哪種方法？因為通過各種方法反應的基團是并且顯色基團不同，因此同時使用幾種方法得到的樣品濃度對于同一樣品是不可比的。例如：凱勒等人。測試了人乳中的蛋白質，Lowry和BCA測得的結果明顯高于Bradford，差異有顯著性。即使測定的是同一個樣品，采用相同比色法選擇的標準樣品也不一致，檢測后的濃度也不一致。例如，Lowry用于檢測細胞勻漿中的蛋白質，以濃度為1.34mg/ml的BSA為標準，以濃度為2.64mg/ml的球蛋白為標準。因此，在選擇比色法之前，*好參考待測樣品的化學成分，尋找與標準品化學成分相似的標準蛋白。另外，比色法定量蛋白質時常存在樣品吸光度值過低的問題，導致測得的樣品濃度與實際濃度相差較大。關鍵問題是反應后，比色皿作為1011分光光度計的重要配件，其顏色有一定的半衰期，所以每種比色法都列出了反應測試時間。所有樣品（包括標準樣品）都必須在此時間內進行測試。時間過長，得到的吸光度值變小，濃度換算值下降。此外，反應溫度和溶液的pH值都是影響實驗的重要因素。此外，*好使用塑料比色法，這一點非常重要。避免使用石英或玻璃制成的比色皿，因為反應后的顏色會使石英或玻璃著色，導致樣品的吸光度不準確。 細 菌細胞密度 (OD 600) 實驗室確定細 菌的生長密度和生長期，根據經驗和目測推斷細 菌的生長密度。當遇到要求更高的實驗時，需要使用分光光度計來準確測定細 菌細胞密度。 OD600 是用于跟蹤液體培養物中微生物生長的標準方法。以未添加細 菌的培養液為空白液，培養后對含有細 菌的培養液進行定量。為確保正確操作，必須用顯微鏡對每種微生物和每種儀器進行細胞計數，并制作校準曲線。偶爾在實驗中，菌液的OD值可能會出現負值。原因是使用了顯色培養基，即細 菌經過一段時間的培養后，與培養基發生反應，引起變色反應。另外，需要注意的是，不能對被測樣品進行離心分離，使細 菌保持懸浮狀態。 分光光度計-比色皿的重要配件 比色杯按材質大致分為石英杯、玻璃杯和塑料杯。根據不同的測量體積，有比色皿和毛細管比色皿。一般用石英杯或玻璃杯檢測核酸和紫外定量蛋白，但不適合比色測定。由于反應中的染料（如考馬斯亮藍）可使石英和玻璃著色，因此必須使用一次性塑料杯。塑料杯一般不適合測試紫外線范圍內的樣品。 由于檢測的樣品量不同，一般分光光度計廠家提供不同體積的比色皿，以滿足用戶的不同需求。目前有一種塑料杯可以同時用于核酸和UV蛋白質的定量和蛋白質的比色測定。樣品體積只需50μl。比色杯單獨無菌包裝，樣品可回收。例如，Eppendorf UVette® 塑料比色皿是目前比色皿市場上的一項創 新。隨著生命科學及相關學科的發展，對這類科學的實驗研究提出了更高的要求。分光光度計將成為分子生物學實驗室以及微生物學、食品、制藥等相關實驗室的儀器。裝備之一。
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