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流式細(xì)胞儀簡(jiǎn)介

1 流式細(xì)胞術(shù)的概念及其發(fā)展歷程
1.1 流式細(xì)胞術(shù)的基本概念
流式細(xì)胞儀（FCM）是一種對(duì)高速線性流動(dòng)細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行快速定量測(cè)定和分析的設(shè)備，主要包括樣品液流技術(shù)、細(xì)胞計(jì)數(shù)與分選技術(shù)、計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)采集與分析技術(shù)。流式細(xì)胞術(shù)以流式細(xì)胞術(shù)為基礎(chǔ)，是流體力學(xué)、激光技術(shù)、電子工程、分子免 疫學(xué)、細(xì)胞熒光化學(xué)、計(jì)算機(jī)等知識(shí)綜合應(yīng)用的結(jié)果。流式細(xì)胞術(shù)是一種自動(dòng)分析和分選細(xì)胞或亞細(xì)胞的技術(shù)。其特點(diǎn)是：測(cè)量速度快，被測(cè)人群大，多參數(shù)測(cè)量，即與同一細(xì)胞的理化特性相關(guān)的多參數(shù)測(cè)量，具有統(tǒng)計(jì)上的有效性。
1.2 流式細(xì)胞術(shù)發(fā)展簡(jiǎn)史
流式細(xì)胞術(shù)*早的原型誕生于1934年，Moldavan提出了讓?xiě)腋〉膯蝹€(gè)紅細(xì)胞流過(guò)玻璃毛細(xì)管，在明場(chǎng)用顯微鏡計(jì)數(shù)，并用光電器件測(cè)量的想法。 1953 年，Crossland-Taylor 基于在圓管中流動(dòng)的牛頓流體設(shè)計(jì)了流動(dòng)室。設(shè)計(jì)了光電檢測(cè)設(shè)備和細(xì)胞分選裝置，并實(shí)現(xiàn)了計(jì)算機(jī)與流式細(xì)胞儀和多參數(shù)數(shù)據(jù)完成。記錄分析，開(kāi)創(chuàng)細(xì)胞免 疫熒光染色檢測(cè)技術(shù)，推廣流式細(xì)胞術(shù)臨床應(yīng)用。近20年來(lái)，隨著流式細(xì)胞術(shù)及其檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，人們?cè)絹?lái)越多地致力于樣品制備、細(xì)胞標(biāo)記、軟件開(kāi)發(fā)等工作，以擴(kuò)大FCM的應(yīng)用領(lǐng)域和使用效果。
根的《流式細(xì)胞術(shù)原理及應(yīng)用》是迄今為止關(guān)于流式細(xì)胞術(shù)及其技術(shù)*詳細(xì)、*透徹的中文書(shū)籍。本書(shū)詳細(xì)介紹了流式細(xì)胞術(shù)的歷史、結(jié)構(gòu)、原理、技術(shù)指標(biāo)等，并舉例說(shuō)明了其在醫(yī)學(xué)和生物工程中的應(yīng)用。非常適合從事該領(lǐng)域?qū)I(yè)研究的人士。本書(shū)自13年前出版以來(lái)，基本不涉及植物流式細(xì)胞儀檢測(cè)技術(shù)。也只為對(duì)于有一定流式細(xì)胞術(shù)基礎(chǔ)知識(shí)的人來(lái)說(shuō)，這本書(shū)太復(fù)雜太深?yuàn)W了。謝曉梅主要介紹了流式細(xì)胞術(shù)在生物工程中的應(yīng)用。楊銳總結(jié)了流式細(xì)胞術(shù)的工作原理，并簡(jiǎn)要提到了流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用。本文在分析了這三篇論文或文章的優(yōu)缺點(diǎn)后，用比較流行的語(yǔ)言介紹了掌握流式細(xì)胞儀檢測(cè)技術(shù)必須了解的一些原理，并對(duì)目前市場(chǎng)上的主流機(jī)型進(jìn)行了客觀的性能總結(jié)。
2 流式細(xì)胞儀工作原理及技術(shù)指標(biāo)
2.1 流式細(xì)胞儀工作原理
流式細(xì)胞儀除電源外，主要由四部分組成：流室和液流系統(tǒng)：激光源和光學(xué)系統(tǒng)；光電管及檢測(cè)系統(tǒng)；計(jì)算機(jī)和分析系統(tǒng)，其中流動(dòng)室是儀器的核心部件。這四個(gè)組件共同完成信號(hào)產(chǎn)生、轉(zhuǎn)換和傳輸?shù)娜蝿?wù)。
2.1.1 信號(hào)產(chǎn)生、轉(zhuǎn)換和傳輸
在壓力作用下，鞘液管內(nèi)的鞘液不斷被壓入流腔，形成穩(wěn)定連續(xù)的液流，保證樣品液的穩(wěn)定性。地面在鞘液流的軸線上并通過(guò)激光單細(xì)胞形式的直線照射區(qū)域。激光照射區(qū)域也稱(chēng)為測(cè)量區(qū)域，是指液體流與激光束垂直相交的點(diǎn)。當(dāng)細(xì)胞攜帶熒光素標(biāo)記物通過(guò)激光照射區(qū)域時(shí)，會(huì)產(chǎn)生代表細(xì)胞內(nèi)不同物質(zhì)和不同波長(zhǎng)的熒光信號(hào)。這些信號(hào)以細(xì)胞為中心以360°立體角發(fā)射，產(chǎn)生散射光和熒光信號(hào)。散射光不依賴(lài)于任何細(xì)胞樣品制備技術(shù)，因此稱(chēng)為細(xì)胞的物理參數(shù)或固有參數(shù)。散射光包括前向角散射和尋向角散射。前向角散射與測(cè)量的細(xì)胞直徑的平方密切相關(guān)。定向角散射光對(duì)細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和核膜的折射率更敏感，可以提供細(xì)胞內(nèi)精細(xì)結(jié)構(gòu)和顆粒特性的信息。還有兩種類(lèi)型的熒光信號(hào)；一種是細(xì)胞自身在激光照射下發(fā)出的微弱熒光信號(hào)，另一種是經(jīng)過(guò)熒光素特異性標(biāo)記的細(xì)胞被激發(fā)和照射后得到的熒光信號(hào)。在免 疫分析中，往往需要同時(shí)檢測(cè)兩種以上波長(zhǎng)的熒光信號(hào)，因此使用分色鏡或分色光譜儀來(lái)有效分離各種熒光。
熒光染色的細(xì)胞在被合適的光激發(fā)后測(cè)量其熒光，通過(guò)光電轉(zhuǎn)換器將其轉(zhuǎn)換為電信號(hào)。*常用的光電轉(zhuǎn)換器是光電倍增管（PMT）. PMT輸出的電信號(hào)需要經(jīng)過(guò)放大后才能輸入到分析儀器中。流式細(xì)胞儀中通常有兩種類(lèi)型的放大器。一種是線性放大器，其輸出信號(hào)與輸入信號(hào)具有線性關(guān)系。線性放大器適用于小范圍變化的信號(hào)和代表線性生物過(guò)程的信號(hào)，例如 DNA 測(cè)量。另一種是對(duì)數(shù)放大器，輸出信號(hào)和輸入信號(hào)有共同的對(duì)數(shù)關(guān)系。對(duì)數(shù)放大器常用于免 疫學(xué)測(cè)量。放大后的電信號(hào)傳輸?shù)接?jì)算機(jī)，再通過(guò)模數(shù)轉(zhuǎn)換器傳輸?shù)轿C(jī)處理器，形成數(shù)據(jù)文件，存儲(chǔ)在計(jì)算機(jī)上。保存在電腦上的數(shù)據(jù)離線后可以進(jìn)行處理和分析。
2.1.2 流式細(xì)胞儀分選原理
并非所有流式細(xì)胞儀都具有分選功能。流式細(xì)胞儀的分選功能由完成。從噴嘴噴出的液流柱在電信號(hào)的作用下振動(dòng)并破碎形成均勻的小液滴。邏輯電路根據(jù)選定的參數(shù)判斷是否進(jìn)行排序，然后充電電路對(duì)選定的電芯進(jìn)行充電。帶電液滴攜帶細(xì)胞通過(guò)靜電場(chǎng)，然后偏轉(zhuǎn)并落入收集器中。使用不同直徑的噴嘴并改變液體流速可能會(huì)改變分選效果。從參數(shù)確定到邏輯選擇再到脈沖充電需要一定的延遲時(shí)間。準(zhǔn)確確定延遲時(shí)間是決定分選質(zhì)量的關(guān)鍵，可根據(jù)具體要求適當(dāng)調(diào)整。
2.1.3 數(shù)據(jù)展示與分析
數(shù)據(jù)處理主要包括數(shù)據(jù)展示和分析。單參數(shù)直方圖是*常用的圖形顯示形式，既可用于定性分析，也可用于定量分析。單參數(shù)直方圖是由 X 和 Y 方向組成的二維平面圖。橫坐標(biāo)X為被測(cè)熒光或散射光的強(qiáng)度，用“通道號(hào)”（Channel No.）表示。選擇的放大器類(lèi)型不同，規(guī)模也不同。縱坐標(biāo) Y 通常表示要測(cè)試的細(xì)胞的優(yōu)良數(shù)量。通常情況下，數(shù)據(jù)分析得到的圖形是一個(gè)或多個(gè)峰的圖形。圖表的解釋?xiě)?yīng)該詳細(xì)分析。
除了直方圖，數(shù)據(jù)顯示方式還包括二維點(diǎn)圖、二維等高線圖、偽三維圖和列表方式。二維點(diǎn)圖也是一種常用的數(shù)據(jù)顯示類(lèi)型。它顯示了兩個(gè)獨(dú)立參數(shù)與細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量之間的關(guān)系。這也是一個(gè)二維的計(jì)劃。由線確定，點(diǎn)的位置表示細(xì)胞和粒子兩個(gè)測(cè)量參數(shù)的值。二維點(diǎn)圖提供的信息量大于單參數(shù)直方圖。
數(shù)據(jù)分析方法大致可以分為兩大類(lèi)：參數(shù)方法和非參數(shù)方法。當(dāng)被測(cè)試的生物系統(tǒng)可以使用某種數(shù)學(xué)模型時(shí)，通常會(huì)使用參數(shù)方法。非參數(shù)分析方法不需要對(duì)顯示的圖像做任何假設(shè)，也不需要使用數(shù)學(xué)模型。分析程序可以簡(jiǎn)單也可以復(fù)雜。非參數(shù)分析方法常用于臨床醫(yī)學(xué)。
2.2 流式細(xì)胞儀性能技術(shù)指標(biāo)
流式細(xì)胞儀性能的技術(shù)指標(biāo)主要包括熒光分辨率、熒光靈敏度、適用樣品濃度、分選純度等。熒光分辨率是指兩個(gè)相鄰峰之間的*小距離，通常用變異系數(shù)（CV值）表示。市面上主流機(jī)型出廠時(shí)熒光分辨率應(yīng)小于2.0%。熒光靈敏度反映了儀器檢測(cè)*小熒光強(qiáng)度的能力。它通常用熒光微球上可以測(cè)量的*小 FITC 分子數(shù)來(lái)表示。目前儀器可以達(dá)到1000左右。儀器工作時(shí)，樣品濃度一般在105-107個(gè)細(xì)胞/毫升之間。分析速度/分選速度是指流式細(xì)胞儀每秒可分析或分選的粒子數(shù)。一般分析速度為5000～10000，分選速度控制在1000以下。
流式細(xì)胞儀測(cè)得的數(shù)據(jù)是一個(gè)相對(duì)值，因此系統(tǒng)需要在使用前進(jìn)行校準(zhǔn)或校準(zhǔn)。流式細(xì)胞儀的校準(zhǔn)有兩個(gè)目的，即儀器的準(zhǔn)直調(diào)整和定量刻度。通常，標(biāo)準(zhǔn)微球作為非生物標(biāo)準(zhǔn)樣品，雞紅細(xì)胞作為生物標(biāo)準(zhǔn)樣品。