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液相色譜儀原理是什么？

高效液相色譜是在經(jīng)典色譜的基礎上，引用了氣相色譜的理論。技術上，流動相改為高壓輸送（*高輸送壓力可達4.9107Pa）；色譜柱用于特殊方法。采用小粒徑填料，柱效遠高于經(jīng)典液相色譜（每米塔板數(shù)可達數(shù)萬或數(shù)十萬）；同時，立柱后方設有高靈敏度檢測器，可對物體進行連續(xù)檢測。
特征
1、高壓：液相色譜以液體為流動相（稱為載液）。液體流過色譜柱并受到更大的阻力。為了快速通過色譜柱，必須對載液施加高壓。一般可達150～350×105Pa。
2、速度快：流動相在柱內的流速比經(jīng)典色譜法快很多，一般可達1-10ml/min。高效液相色譜所需的分析時間遠小于經(jīng)典液相色譜，一般小于1h。
3. 高效：*近開發(fā)了許多新的固定相，大大提高了分離效率。
4、靈敏度高：高效液相色譜廣泛采用高靈敏度檢測器，進一步提高分析靈敏度。例如熒光檢測器的靈敏度可達10-11g。此外，樣品體積較小，通常為幾微升。
5、應用范圍廣：氣相色譜與高效液相色譜對比：氣相色譜雖然具有分離能力好、靈敏度高、分析速度快、操作方便等優(yōu)點，但受技術條件限制，沸點太高高的。高物質或熱穩(wěn)定性差的物質很難用氣相色譜法分析。高效液相色譜法只需要將樣品制成溶液即可，不需要汽化，因此不受樣品揮發(fā)性的限制。對于沸點高、熱穩(wěn)定性差、相對分子量大（400以上）的有機物（這些物質幾乎占有機物總量的75%～80%），原則上可采用高效液相色譜法用于分離和分析。據(jù)統(tǒng)計，在已知的化合物中，約20%可以用氣相色譜分析，約70-80%可以用液相色譜分析。
高效液相色譜可分為高效凝膠色譜、疏水高效液相色譜、反相高效液相色譜、高效離子交換液相色譜、高效親和液相色譜和高效聚焦液相色譜等類型。不同類型的高效液相色譜分離或分析各種化合物的原理與相應的普通液相色譜的原理基本相同。喜歡。不同的是，高效液相色譜靈敏度高、速度快、分辨率高、重復性好，必須在色譜儀上進行。
高效液相色譜的主要類型及其分離原理
根據(jù)分離機理的不同，高效液相色譜可分為以下主要類型：
1. 液液分配色譜和化學鍵合相色譜
流動相和固定相都是液體。流動相與固定相應不混溶（極性不同，避免固定液流失），并應有明顯的界面。當樣品進入色譜柱時，溶質分布在兩相之間。當達到平衡時，遵循以下公式：
式中，cs——固定相中溶質的濃度； cm——流動相中溶質的濃度； Vs——固定相的體積； Vm——流動相的體積。 LLPC和GPC有相似之處，就是分離的順序取決于K，K越大的分量保留越大的值；但也存在差異。 GPC中flow對K影響不大，LLPC flow對K影響較大
a.正相液相色譜（NormalPhaseliquidChromatography）：流動相的極性小于固定液的極性。
灣反相液相色譜（ReversePhaseliquidChromatography）：流動相的極性大于固定液的極性。
C。液液分配色譜的缺點：雖然流動相和固定相的極性要求不同，但固定液在流動相中仍有少量溶解；流動相通過色譜柱時的機械沖擊力會影響固定液的流失。 1970 年代后期發(fā)展起來的化學鍵合固定相（見下文）可以克服上述缺點。現(xiàn)在被廣泛使用（70~80%）。
2. 液固色譜法
流動相為液體，固定相為吸附劑（如硅膠、氧化鋁等）。這是根據(jù)吸附物質的不同來進行分離的。作用機理是：當樣品進入色譜柱時，溶質分子（X）和溶劑分子（S）競爭吸附在吸附劑的表面活性中心上（不進樣時，吸附劑的所有活性中心吸附S)，可以表示為：
Xm+nSa======Xa+nSm
其中： Xm——流動相中的溶質分子； Sa——固定相中的溶劑分子； Xa——固定相中的溶質分子； Sm——流動相中的溶劑分子。
當吸附競爭反應達到平衡時：
K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa]
其中： K 是吸附平衡常數(shù)。 【討論：K越大，保留值越大。 ]
3. 離子交換色譜（Ion-exchange Chromatography）
IEC 使用離子交換劑作為固定相。 IEC 基于離子交換樹脂上的可電離離子與流動相中具有相同電荷的溶質離子的可逆交換。這些離子根據(jù)交換劑的不同親和力進行分離。
以陰離子交換劑為例，交換過程可表示為：
X-(在溶劑中)+(樹脂-R4N+Cl-)===(樹脂-R4N+X-)+Cl-(在溶劑中)
當交換達到平衡時：
KX=[-R4N+X-][Cl-]/[-R4N+Cl-][X-]
分配系數(shù)為：
DX=[-R4N+ X-]/[X-]=KX[-R4N+Cl-]/[Cl-]
【討論：DX與留存的關系】
凡能在溶劑中電離的物質，通常都可以用離子色譜法進行交換分離。
4. 離子對色譜（Ion Pair Chromatography）
離子對色譜是將與溶質分子電荷相反的一個（或多個）離子（稱為反離子或反離子）加入流動相或固定相中，使其與溶質離子結合形成疏水性離子對化合物，從而控制溶質離子的保留行為。其原理可用下式表示：
X+水相+Y-水相===X+Y-有機相
其中： X+水相--要在流動相中分離的有機離子（也就是陽離子）； Y-水相-流動相中帶相反電荷的離子對（如四丁基氫氧化銨、十六烷基三 甲基氫氧化銨等）； X+Y---形成的離子對化合物。
當達到平衡時：
KXY=[X+Y-]有機相/[X+]水相[Y-]水相
根據(jù)定義，分配系數(shù)為：
DX=[X+Y-]有機相/[X+]水相=KXY[Y-] 水相
【討論：DX與留存的關系】
離子對色譜（特別是反相）解決了以往難以分離的混合物的分離問題，如酸、堿和離子、非離子混合物，特別是一些生化樣品如核酸、核苷、生物堿、和藥 物分開。
5. 離子色譜
使用離子交換樹脂作為固定相，電解質溶液作為流動相。電導檢測器用作通用檢測器。為了消除流動相中強電解質背景離子對電導檢測器的干擾，設置了抑制柱。分離柱和抑制柱上樣品組分的反應原理與離子交換色譜法相同。
以陰離子交換樹脂（R-OH）為固定相分離陰離子（如Br-）為例。當被測陰離子Br-隨流動相（NaOH）進入色譜柱時，發(fā)生如下交換反應（洗脫反應是交換反應的逆過程）：
抑制柱上的反應：
R-H++Na +OH-===R-Na++H2O
R-H++Na+Br-===R-Na++H+Br-
可以看出，洗脫液通過抑制柱轉化為電導率。水的小值消除了背景電導率的影響；樣品陰離子Br-轉化為相應的酸H+Br-，可通過電導法靈敏檢測。
離子色譜法是分析溶液中陰離子的*佳方法。也可用于陽離子分析。
6. 空間排阻色譜
空間排阻色譜使用凝膠作為固定相。它的作用與分子篩相似，但凝膠的孔徑比分子篩大很多，一般在幾納米到幾百納米。溶質不是通過兩相之間不同的相互作用力分離的，而是通過分子大小分離的。分離僅與凝膠的孔徑分布和溶質的流體力學體積或分子大小有關。樣品進入色譜柱后，隨流動相在凝膠外和孔旁的間隙中流動。在樣品中，一些過大的分子無法進入凝膠孔而被排除，因此它們直接通過色譜柱，首先出現(xiàn)在色譜圖上。一些非常小的分子可以進入所有的凝膠孔并滲透到顆粒中。這些組分 色譜柱上的保留值*大，并且出現(xiàn)在色譜圖的*后。
高效液相色譜儀主要包括進樣系統(tǒng)、輸液系統(tǒng)、。分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，下面將分別介紹它們的組成和特點。
1. 采樣系統(tǒng)
一般采用隔膜進樣器或高壓進樣室完成進樣操作，進樣量恒定。這有利于提高分析樣品的重復性。
2. 輸液系統(tǒng)
該系統(tǒng)包括三部分：高壓泵、流動相容器和梯度計。高壓泵的一般壓力為l。 47～4.4X107Pa，流量可調穩(wěn)定。當高壓流動相通過色譜柱時，可以降低樣品在柱內的擴散效應，加快其在柱內的移動速度，有利于提高分離度和樣品的回收率。 、保持樣品的生物活性等都是有益的。流動相儲存誤差和梯度計可以根據(jù)固定相和樣品的性質改變流動相，包括改變洗脫液的極性、離子強度和pH值，或使用競爭性抑制劑或變性劑。這使得多種物質（即使只有一組差異或異構體）可以有效分離。
3.分離系統(tǒng)
本系統(tǒng)包括色譜柱、連接管和恒溫器等部分。色譜柱的長度一般為10-50cm（需要兩臺聯(lián)用時，可在兩者之間加一根連接管），內徑為2-5mm，采用上等不銹鋼或厚壁玻璃管或鈦合金制成。有粒徑為5-10μm的固定相（由基質和固定液組成）。固定相中的基質由機械強度高的樹脂或硅膠制成，它們都是惰性的（如硅膠表面的堿性硅酸基因）。已去除）、孔隙率（孔徑可達1000?）和大的比表面積，再加上其表面被機械包覆（與氣相色譜中固定相的制備相同），或化學偶聯(lián)各種基因（如Phosphoric酸基、季胺基、羥甲基、苯基、氨基或各種長度的碳鏈烷基等）或配體有機化合物。因此，這種固定的相對結構具有良好的選擇性。例如，在多孔硅膠表面偶聯(lián)豌豆凝集素 (PSA) 后，可以分離成纖維細胞中的糖蛋白。
另外，固定相基質粒小，柱床容易達到均勻致密的狀態(tài)，容易降低渦流擴散的影響。基體粒徑小，微孔淺，樣品在微孔區(qū)傳質短。這些有利于減小帶寬和提高分辨率。根據(jù)柱效理論分析，基質粒徑小，理論板數(shù)N較大。這也進一步證明了堿基質粒分辨率小的原因會增加分辨率。
此外，高效液相色譜的恒溫器可以將溫度從室溫調節(jié)到60℃。通過提高傳質速率和縮短分析時間，可以提高色譜柱的效率。
4.檢測系統(tǒng)
高效液相色譜中常用的檢測器有三種：紫外檢測器、折光率檢測器和熒光檢測器。
(1) 紫外線檢測器
該檢測器適用于檢測吸收紫外光（或可見光）的樣品。其特點：用途廣泛（如蛋白質、核酸、氨基酸、核苷酸、肽、激 素等）；靈敏度高（檢出限為10-10g/ml）；線性范圍寬；溫度和流速無變化 靈敏；可以檢測用梯度溶液洗脫的樣品。
(2) 示差折光檢測器
折射率與流動相不同的所有樣品組分都可以通過示差折光檢測器進行檢測。目前，大部分碳水化合物化合物的檢測都采用這種檢測系統(tǒng)。該系統(tǒng)通用性強，操作簡單，但靈敏度低（檢出限為10-7g/ml）。流動相的變化會引起折射率的變化。因此，既不適合痕量分析，也不適合痕量分析。梯度洗脫樣品檢測。
(3) 熒光檢測器
對于具有熒光的物質，在一定條件下，發(fā)出的光的熒光強度與該物質的濃度成正比。因此，該檢測器僅適用于熒光有機化合物（如多環(huán)芳烴、氨基酸、胺類、維生素和某些蛋白質等）的測定，其靈敏度非常高（檢出限為10-12～ 10-14g/Ml)，既可以進行痕量分析，也可以進行梯度洗脫檢測工作。
(5) 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)
該系統(tǒng)可以采集、存儲、顯示、打印和處理測試數(shù)據(jù)，從而正確地進行樣品的分離、制備或識別。