引物設計基本原則
- 引物長度：18-26bp，可放寬至18-30bp（有研究表明超過30bp再增加引物長度意義不大）；
- 引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C 過多易出現非特異條帶。ATGC*好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列存在；
- 引物Tm：54-58℃，可放寬至52～62℃，GC%>60%可進一步放寬；
- 擴增子Tm：>92℃；
- 3'端：優選三聯體WSS、SWS、TTS，二連體GC，單體S，盡量規避WWW、CGW、GGG、CG；
- 引物與非特異擴增區的序列的同源性不要超過70%，引物3′末端連續8個堿基在待擴增區以外不能有互補序列，否則易導致非特異性擴增；
- 末端2bp*好為GC；
- 引物的5′端可以修飾。如附加限制酶位點，引入突變位點，用、熒光物質、標記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等；
- 其他：避免3'端8bp及以上序列與模板多位點互補，盡量避免上下游3'端4bp及以上反向互補，盡量避免內部回文。
基于上述原則，應用分兩種情況：
(1) 基因克隆PCR引物設計
這種情況我們往往并沒有太多選擇，只能從ATG開始，從TAA等結束，什么GC%、二聚體和錯配，可能根本由不得我們。既然起點定了，那只能通過改變長度來匹配*優設計要求了。
(2) 鑒定PCR引物設計
我們只需要確認一段DNA序列上的一部分，起點是相對的，我們可以在整個序列范圍內搜索，引物設計的靈活性大大提高，當然搜索時間也要增加。
