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ELISA雙抗夾心法操作步驟：

ELISA實(shí)驗(yàn)開始前，各試劑均應(yīng)平衡至室溫（試劑不能直接在37℃溶解）。試劑或樣品稀釋時(shí)，確?；靹颍瑫r(shí)盡量避免起泡。

1.包被抗體：用碳酸鹽緩沖液（CBS）或者磷酸鹽緩沖液（PBS）根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，將包被抗體稀釋到一定的稀釋度，100μl/孔包被， 37℃、2h或者4℃過(guò)夜。

2.洗板：棄孔內(nèi)液體，甩干，10mM PBST(10mM PBS 0.05% Tween-20)洗板2次，每次浸泡1-2min， 350μl/孔，甩干（也可以輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。

3.封閉：含1% BSA或者5%脫脂牛奶的10mM PBST(10mM PBS 0.05% Tween-20)做封閉液，350-400μl/孔，37℃、2h。

4.洗板：同步驟2。（備注：商品化試劑盒一般已經(jīng)預(yù)包被了包被抗體在酶標(biāo)板上，不需要進(jìn)行1-4步驟，使用前請(qǐng)注意核實(shí)）。

5.加樣：分別設(shè)零孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00μl，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100μl。（注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，一塊板要在10 min內(nèi)上完樣品。）酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)60-120min。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

6.洗板：棄孔內(nèi)液體，甩干，10mM PBST（10mM PBS 0.05% Tween-20）洗板4次，每次浸泡1-2min，350-400μl/孔，甩干（也可以輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。

7.加檢測(cè)抗體：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，將檢測(cè)抗體用PBST稀釋到一定的稀釋度，100μl/孔，37℃、1h。

8.洗板：同步驟6。

9.加二抗：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，將二抗用10mM PBST稀釋到一定的稀釋度，100μl/孔，37℃、1h。

10.洗板：同步驟6。

11.酶標(biāo)儀讀值：以630nm為校正波長(zhǎng)，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值），在加終止液后5min內(nèi)進(jìn)行讀數(shù)。

12.結(jié)果判斷：

a.每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣本的OD值須減去零孔的OD值，如設(shè)置復(fù)孔，則應(yīng)取其平均值；

b.以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，使用專業(yè)制作曲線軟件進(jìn)行四參數(shù)擬合（4-PL），如Origin、ELISACalc等，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線推算出相應(yīng)的擬合濃度，再乘以稀釋倍數(shù)即為樣本的測(cè)定濃度。